Desarrollan un método de biología molecular para detectar virus de VIH y Hepatitis C

Los análisis serológicos tradicionales, que se practican para determinar si una persona está infectada con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o Hepatitis C, son indirectos. No detectan esos agentes patógenos por sí mismos, sino los anticuerpos que genera el sistema inmunológico del organismo infectado como defensa. El tiempo que demoran éstos en aparecer varía entre tres y doce semanas, pero está comúnmente aceptado que estos anticuerpos pueden ser reconocidos con certeza entre 45 y 50 días posteriores al contagio. Durante ese "período de ventana", los estudios convencionales brindarán resultados negativos, aunque la sangre de la persona portadora podrá contagiar mediante transfusiones sanguíneas o relaciones sexuales en las que no se utilicen métodos profilácticos.

¿Cómo saber, entonces, si un donante no se encuentra en ese período de ventana al momento de someterse a una extracción de sangre? La respuesta viene de la mano de la biología molecular, una disciplina que estudia la estructura, función y composición de las moléculas biológicamente importantes. En este caso, la molécula analizada es el ácido ribonucleico (ARN), constituyente del material genético de los virus HIV y Hepatitis C.

Mediante la aplicación de técnicas de biología molecular, Mariana Núñez, coordinadora del Área Química Molecular del Cequimap en la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) desarrolló un método cualitativo directo que permite identificar la presencia de ARN específico correspondiente a los virus del VIH y la Hepatitis C en el plasma humano. Su principal ventaja radica en su especificidad, ya que reconoce secuencias de ARN propias de los virus de HIV y Hepatitis C, y en su mayor sensibilidad, lo que permite reducir el período de ventana a sólo 11 días. La técnica en cuestión se denomina "transcriptasa reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real" (RT/RT-PCR, por sus siglas en inglés) y es el proceso en el que durante casi dos años trabajó la científica para optimizar y poner a punto.

En términos simples, el proceso consiste en multiplicar exponencialmente el material genético de los virus -si es que están presentes en la muestra analizada- hasta hacerlos "visibles" mediante un equipamiento específico. El método posee una estricta serie de pasos, pero la clave de su éxito radica en la secuencia de ADN que posibilita y sirve de molde para su amplificación y detección. Precisamente, es esta secuencia de ADN la que diseñó a medida la investigadora del Cequimap, utilizando información de los genomas de cepas de VIH y Hepatitis C aisladas en Argentina.

La metodología fue desarrollada a partir de un convenio con el Instituto de Hematología y Hemoterapia (IHH) de la UNC. El Banco de Sangre de esta Casa de Estudios ya la viene aplicando desde noviembre de 2008, complementariamente con los estudios serológicos tradicionales que fija la legislación sobre las normas de medicina transfusional. Su inclusión apunta a asegurar la calidad de la sangre disponible en esa dependencia sanitaria. Mediante esta técnica, el Cequimap analiza aproximadamente unas 600 muestras sanguíneas mensuales remitidas por el IHH. [Más información sobre el acuerdo interinstitucional, en este artículo publicado en el portal web de la UNC].

El abecé del material genético

Para comprender acabadamente el método, es necesario partir de ciertos conocimientos básicos. El ADN (ácido desoxirribonucleico) es la información genética básica que se transmite de una generación a otra y que codifica los datos necesarios para la síntesis de proteínas indispensables para el funcionamiento de la célula o partícula viral. 

El ADN está conformado por combinaciones de cuatro bases nitrogenadas denominadas "nucleótidos": adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C), unidas en dos ejes de azúcar-fosfato. Como polos opuestos de un imán, la adenina siempre estará apareada a la timina y la guanina a la citosina, y viceversa (en combinaciones A-T, T-A, C-G y G-C).

Gráficamente, una molécula de ADN es representada como una doble hélice, es decir, como una escalera caracol, cuyos peldaños se mantienen unidos por dos cadenas o hebras en sus extremos. En este modelo, los escalones son las uniones A-T, T-A, C-G y G-C, mientras que las hebras son ejes de azúcar-fosfato que funcionan como un esqueleto.

 Esta representación gráfica puede incluso simplificarse en el siguiente diagrama:

Sin embargo, en algunos virus -como VIH y Hepatitis C- el material genético se encuentra en moléculas de ARN, también está compuesto por cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), uracilo (U), guanina (G) y citosina (C). Estos virus se conocen como retrovirus, el nombre hace referencia a que poseen un modo inverso de replicar el ácido nucleico. Es decir, a partir de ARN "sintetizan" el ADN vírico que sirve de molde para obtener múltiples copias de ARN viral. Esta reacción es catalizada por la enzima denominada transcriptasa reversa.

Eureka

Mientras conducía por una ruta en 1983, el bioquímico Kary Mullis –que trabajaba en una empresa de biología molecular radicada en California– ideó una técnica in vitro para generar, a partir de una única molécula de ADN, millones de copias idénticas en pocas horas. Fue denominada "reacción en cadena de la polimerasa" (o PCR, por sus siglas en ingles).

¿Cómo funciona? Al someter un fragmento de ADN a una temperatura de 95°C durante un período que oscila entre 30 y 60 segundos aproximadamente, la doble hebra de ADN se separa. En esta etapa, denominada "desnaturalización", se rompen los puentes de hidrógeno que mantienen conectadas las adeninas y las citosinas de una hebra, con las timinas y las guaninas de la otra hebra, respectivamente.

Cuando esto sucede, se agregan dos "primers" o "iniciadores", pequeñas secuencias de nucleótidos que, al descender la temperatura a unos 55°C, se adherirán a cada una de las hebras individuales en los extremos de una región específica, buscando los tramos de ADN que le son complementarios para aparearse.

Con la incorporación de una enzima, denominada ADN polimerasa -una proteína que motoriza la reacción de síntesis de ADN-, se generan las porciones faltantes de ambas hebras hasta obtener dos copias iguales de ADN doble hebra. Estos pasos conforman un ciclo que se repite aproximadamente 30 veces (por eso el término "en cadena") hasta obtener más de mil millones de moléculas de ADN idénticas. Todo esto ocurre dentro de un equipo especial denominado termociclador. Esta técnica, que está profusamente descripta en bibliografía, es muy utilizada en laboratorios de investigación y de diagnóstico molecular, y su versatilidad radica en el "primer" que diseñe el científico según el fragmento de ADN que quiere amplificar.

De todos modos, la PCR sólo es capaz de amplificar moléculas de ADN. Para el diagnóstico molecular de los retrovirus, primero es necesario convertir sus moléculas de ARN a ADN, y esto es posible gracias a la enzima transcriptasa reversa. Recién a partir de este punto se puede aplicar la PCR, y en rigor, esto es lo que realiza el Cequimap para identificar los virus del VIH y la Hepatitis C en el plasma humano.

La metodología, paso a paso

En la Universidad Nacional de Córdoba, las extracciones se efectúan en el Instituto de Hematología y Hemoterapia y de cada una se envía una muestra ínfima: 1,5 mililitros bastan para la comprobación. De ella se extrae el plasma -que representa aproximadamente el 50 por ciento de su volumen- y se purifica con una serie de reactivos para separar el material genético (ARN).

Mediante la transcriptasa reversa, ese ARN se convierte en ADN -comúnmente denominado ADN complementario (ADNc) y se somete a la PCR. En este punto entra en juego los primers que diseñó Mariana Núñez, del Cequimap.

Se trata de secuencias de 26 nucleótidos, que son complementarias a regiones conservadas del ADNc de cepas de referencia internacionales de los virus VIH y Hepatitis C, así como el de sus variantes "criollas" (locales y regionales). Su desarrollo implicó un extenso proceso de investigación, porque si bien existen bases de datos con el mapa genético de cada agente patógeno, el desafío fue encontrar, entre las múltiples alternativas de combinación, aquella que experimentalmente permitiera detectar el mayor rango de partículas virales.

¿Cómo se arriba al diagnóstico? Como los primers diseñados corresponden a información genética de los virus, podrán adherirse únicamente cuando encuentren una región de ADN complementaria en una de las hebras del ADNc proveniente del ARN viral. De no detectar estas secuencias específicas, los primers no se alinearán y tampoco se producirá la amplificación de las moléculas, confirmando la ausencia de los virus de VIH y Hepatitis C.

Cabe señalar que el proceso que aplica el Cequimap se realiza en tiempo real. Es decir, mientras las reacciones ocurren dentro del termociclador, ciertas sondas fluorescentes indican si se produce la multiplicación en cada ciclo de amplificación. Esto agrega una sensibilidad dos veces mayor que la técnica PCR tradicional, en la cual el material procesado debe pasar por una última etapa para verificar si se produjo la multiplicación. Esto implica manipular la muestra luego de la PCR, lo que incrementa el riesgo de contaminación del ensayo, y con ello la posibilidad de que ocurran falsos positivos.

Cabe aclarar que, como todo método, el RT/RT-PCR tiene sus limitaciones. En la actualidad, ningún método de diagnóstico serológico o molecular asegura un riesgo de infección cero para el uso de sangre proveniente de donantes. Las restricciones están dadas por la carga viral de VIH y Hepatits C que posea el donante al momento de la extracción de sangre. Ocurre que debajo de cierto umbral, la RT/RT-PCR no podrá identificar la presencia de estos virus.

Validación

Para validar el método, se realizaron pruebas con paneles de cepas de diferentes serotipos y muestras con diferentes concentraciones de partículas virales, que son provistos por la Organización Mundial de la Salud y distribuidos por el National Institute for Biological Standards and Control (Reino Unido).

Actualmente, el Cequimap tramita la acreditación del método ante el Organismo Argentino de Acreditación bajo la norma NM ISO 15189:2008 (Laboratorios de análisis clínicos – Requisitos particulares para la Calidad y la Competencia), una gestión que las autoridades de ese centro de investigación universitario prevén completar para fines de 2009.